Игра продолжается вскоре после событий Assassin’s Creed, где, в 2012 году, Дезмонду Майлсу — пленнику «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке-ассасине Альтаире в машине «Анимус», — грозит смертельная опасность. «Абстерго», современный эквивалент рыцарей-тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема», или «Яблоком». Используя Орлиное зрение, полученное в результате «эффекта просачивания» (из-за частого нахождения в «Анимусе»), Дезмонд видит сообщения и символы, написанные кровью на стене его спальни предыдущим испытуемым, именуемым «Объект 16». Люси Стиллман, сотрудник Абстерго и член братства современных ассасинов, освобождает Дезмонда и прячет его в секретном укрытии с двумя другими ассасинами, Шоном Гастингсом и Ребеккой Крэйн, создавшими улучшенную версию «Анимуса». Они предлагают Дезмонду использовать генетическую память о его предке, Эцио Аудиторе да Фиренце, с двумя целями: тре